Uno de los métodos de utilidad más general para el fraccionamiento de las proteínas es el de la cromatografía, técnica desarrollada para separar pequeñas moléculas como azúcares y aminoácidos. Un tipo muy común de cromatografía todavía muy utilizado actualmente para separar pequeñas moléculas, es la cromatografía de partición.
Típicamente, una gota de la muestra se aplica como una mancha en una hoja de material absorbente inerte, como celulosa o gel de sílice (cromatografía en capa fina). A continuación, se deja que una mezcla de disolventes, como por ejemplo el agua y un alcohol, impregne la hoja desde unos de sus extremos; a medida que el líquido se va desplazando a través de la hoja, va separando las moléculas de la muestra en función de la solubilidad de cada uno de los dos disolventes.
Los disolventes se escogen de forma que uno de ellos se adsorba con mayor intensidad en el material que el otro formando una capa de disolvente estacionario en la superficie de la hoja. En cada región de la hoja las moléculas se equilibran entre el disolvente estacionario y el móvil: las que son más solubles en el disolvente fuertemente adsorbido son relativamente retardadas porque consumen más tiempo en la capa estacionaria, mientras que las que son más solubles en el otro disolvente se mueven más rápidamente. Después de un cierto número de horas, la hoja se seca y se tiñe para localizar la situación de las diferentes moléculas.
